ノックイン細胞とは?目的や作り方について解説
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ノックイン細胞とは
ノックイン細胞とは、遺伝子編集技術などにより特定の遺伝子領域(標的遺伝子領域)へ任意の遺伝子配列を導入した細胞のことを言い、例えば標的遺伝子下流に蛍光タンパク質遺伝子などのレポーター遺伝子を導入したノックイン細胞では、標的遺伝子発現の動態をリアルタイムで観察することなども可能となるため、細胞生物学や生理学的研究などで広く用いられています。また近年では、細胞へ疾患の原因と予想される遺伝子変異(繰り返し配列や点変異など)を導入することで、遺伝子疾患の評価モデルとしても用いられています。
CRISPR/Cas9を用いたノックイン細胞の作り方
1.標的遺伝子と導入配列の決定
研究目的に応じ、導入する遺伝子配列と、導入される標的遺伝子領域を決定します。
2.ガイドRNAの設計
導入する遺伝子配列を組み込むため、標的遺伝子領域上に目的に沿ったガイドRNA (gRNA) を設計します。
3.ドナーDNAの設計
導入する遺伝子配列を含むドナーDNAを設計します。ドナーDNAには導入する遺伝子配列以外に、ノックインに必要なガイドRNA設計箇所周辺の相同性配列や、導入する遺伝子配列機能を十分に発揮させるためのプロモーターなどの発現調節配列を含めて目的のノックイン細胞に沿った設計をすることが重要です。
4.gRNAとドナーDNAベクター、遺伝子編集ツールの導入
作製した遺伝子編集ツール(Cas9やgRNA、ドナーDNA)を、リポフェクションやエレクトロポレーションにより細胞へ導入します。
5.細胞の培養
遺伝子編集ツールを導入した細胞について適切な培養条件下で培養し、正常に増殖することを確認します。
6.クローニングと純化
標的遺伝子領域へ遺伝子配列が導入された細胞を選別するため、限界希釈法などを用いてシングルセル化し、クローン細胞株を樹立します。樹立された細胞株において遺伝子編集の確認のためPCR、シーケンシングなどを行い、目的のノックイン細胞株を確立します。
7.機能解析
導入された遺伝子配列が細胞内で期待される機能を果たしているか、発現タンパク質の定量解析や局在・活性解析などの研究目的に即した試験を行います。
注意点
オフターゲット効果
細胞内に導入した遺伝子編集ツールが、標的遺伝子領域以外でもワークしてしまい(特に、近傍に類似した配列があるなどの場合)、当該箇所を切断・導入されてしまうこと。Cas9の利用による遺伝子編集においては不可避的な事象ではありますが、これを極力回避するため、ガイドRNAの設計においてはオフターゲット効果の低い箇所を慎重に選択し、且つ実際の切断効率・箇所を確認するなど、事前の検証を重ねる必要があります。
シングルセル化後の増殖機能
シングルセル化した後、単独では非常に増殖しにくい性質を持つ細胞があります。そのようなケースでは、クローン化の作業が滞ってしまい、実際の研究実験に供することができないこととなってしまう可能性があります。この点も関連論文を検索するなど、可能な限り事前に確認する必要があります。
アレル数の増減
継代・増殖等により染色体数が異常に増減する性質を持つ細胞では、遺伝子編集後の解析が実質的に不可能となってしまうことがあります。この点も関連論文を検索するなど、可能な限り事前に確認する必要があります。
ゲノム安定性の確保
外来遺伝子の導入によるゲノム不安定性を考慮し、場合によっては細胞の健全性が損なわれないか長期的な観察が必要なケースもあります。