Western Blot
Western Blot（ウエスタンブロット）は、特定のタンパク質の存在を検出し、その量を測定するための強力な実験手法です。この手法は、生物学、医学、バイオテクノロジーなどの分野で広く利用されています。
Western Blotの手順
1.サンプル準備
- タンパク質を抽出し、サンプルバッファーに溶解します。このバッファーには、タンパク質の立体構造を破壊し、陰性に荷電させるための陰イオン系界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）や、ジスルフィド結合を還元する2-メルカプトエタノールが含まれます。
2.電気泳動（SDS-PAGE）
- SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、タンパク質を分子量に基づいて分離します。SDSにより、すべてのタンパク質が均一に陰性荷電されるため、タンパク質は主に分子量の違いによって分離されます。
3.転写（ブロッティング）
- 分離されたタンパク質をゲルからニトロセルロース膜（メンブレン）やポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に電圧をかけて転写します。これにより、タンパク質は安定な支持体上に固定されます。
4.ブロッキング
- 膜の非特異的結合部位をブロックするために、スキムミルクやBSA（ウシ血清アルブミン）などのブロッキング剤を用います。これにより、後の免疫染色での非特異的な結合を防ぎます。
5.一次抗体の適用
- 膜に対して、特定のターゲットタンパク質を認識する一次抗体を適用します。一次抗体はターゲットタンパク質に特異的に結合します。
6.二次抗体の適用
- 一次抗体に結合する二次抗体を反応させます。二次抗体には酵素や蛍光標識されている抗体を用います。ターゲットタンパク質の検出を可能にします。
7.検出
- 二次抗体の標識に応じて、化学発光、蛍光、色素沈着などの方法でターゲットタンパク質を検出します。化学発光を利用する場合、発光物質（例えば、ルミノール）を基質として用い、発光を画像化装置やX線フィルムで記録します。
Western Blotの応用
- タンパク質の同定: 特定のタンパク質の存在を確認するために使用されます。例えば、病気のバイオマーカーとして知られるタンパク質の検出に利用されます。
- 定量解析: タンパク質の発現レベルを比較するために用いられます。例えば、治療薬の効果を調べるために、治療前後のタンパク質発現を比較します。
- タンパク質修飾の解析: タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アセチル化など）を調べるために使用されます。修飾特異的抗体を用いることで、特定の修飾状態のタンパク質を検出できます。
Western Blotの利点
- 特異性: 特異的な抗体を用いるため、目的のタンパク質を正確に検出することができます。
- 感度: 微量のタンパク質でも検出可能であり、感度が高い方法です。
- 定量性: 発現レベルの比較が可能であり、相対的な定量ができます。
Western Blotの制限
- 手間と時間: 手順が多く、時間がかかるため、実験のセットアップと実行には経験が必要です。
- 抗体の依存性: 特異的な抗体の質に依存するため、抗体の選択が重要です。抗体の特異性と感度が結果に大きく影響します。
- 定量の限界: 完全な定量には限界があり、相対的な比較に留まることが多いです。絶対定量には、補助的な方法（例：標準タンパク質の使用）が必要です
研究と応用の未来
- 高感度検出技術の開発: 化学発光や蛍光を利用した高感度検出技術の開発が進んでいます。これにより、より微量なタンパク質の検出が可能になります。
- 自動化と高スループット化: 自動化装置の導入により、Western Blotの手順が効率化され、多くのサンプルを同時に解析することが可能になっています。
- 新しい標識技術: ナノ粒子や量子ドットを利用した新しい標識技術が開発され、検出感度と特異性が向上しています。
Western Blotは、タンパク質研究における基礎的な手法であり、その応用範囲は広範です。この技術の発展により、分子生物学、医学、バイオテクノロジーの分野での研究が進展し、新しい知見が得られています。
