RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）は、RNAを鋳型として逆転写により生成された相補的DNA（cDNA）を基に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う技術です。この技術は、遺伝子発現の解析やRNAウイルスの検出など、分子生物学や臨床検査で広く利用されています。

RT-PCRの基本原理

1-1.逆転写（Reverse Transcription）

1. RT-PCRの第一段階は、RNA分子を鋳型として相補的DNA（cDNA）を生成する逆転写反応です。この反応は、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）によって行われます。

1-2.PCR（Polymerase Chain Reaction）

1. 生成されたcDNAを鋳型にして、通常のPCRが行われます。PCRは、特定のDNA配列を増幅する技術であり、鋳型DNAの複製を数百万倍に増幅することが可能です。
2. PCR反応は、Denaturation（高温でDNA鎖を分離）、Annealing（プライマーがDNAに結合）、Extension（DNAポリメラーゼによる新しいDNA鎖の合成）の3つのステップを温度サイクルとして繰り返します。特定の遺伝子配列をターゲットにしたプライマーを使用することで、高い特異性を持って検出を行います。

2.結果の検出

1. 増幅されたDNA産物は、アガロースゲル電気泳動を使用して定量されます。この段階で、対象とする遺伝子の発現レベルやRNAウイルスの存在を確認します。

3.リアルタイムPCRの使用

1. 通常のPCRとアガロースゲル電気泳動を行う代わりに、リアルタイムPCRによりcDNAの定量を行うことも可能である。

RT-PCRの応用

1.遺伝子発現解析

1. RT-PCRは、特定の遺伝子がどの程度発現しているかを調べるために広く用いられています。細胞や組織から抽出したRNAを基に、特定の遺伝子のmRNA発現量を測定し、遺伝子発現の制御メカニズムを解明するのに役立ちます。

2.病原体の検出

1. RNAウイルス（例：インフルエンザウイルス、HIV、SARS-CoV-2など）の検出にRT-PCRが利用されています。ウイルスのRNAをcDNAに変換し、その後のPCRによってウイルスの存在を確認することで、感染症の早期診断が可能になります。

3.組織特異的発現の解析

1. 異なる組織や細胞タイプ間での遺伝子発現の違いを調べるためにRT-PCRが使用されます。これにより、特定の遺伝子がどの組織でどの程度発現しているかを解析できます。

注意点

RNAの不安定性

1. RNAは非常に不安定で、RNaseによる分解を受けやすいため、サンプルの取り扱いや保存には細心の注意が必要です。

逆転写効率のばらつき

1. 逆転写の効率は、使用する逆転写酵素やRNAの質によって変動するため、実験結果にばらつきが生じることがあります。

RT-PCRの進化と応用の未来

デジタルPCRとの融合

1. RT-PCRとデジタルPCRを組み合わせることで、より高感度かつ定量性の高い遺伝子発現解析が可能になりつつあります。

マルチプレックスRT-PCR

1. 一度に複数の遺伝子を同時に解析できるマルチプレックスRT-PCRが開発され、診断の迅速化と効率化が期待されています。

次世代シークエンシング（NGS）との連携

1. RT-PCRで得られたcDNAを次世代シークエンシングにかけることで、RNAの全体的な発現プロファイルやスプライシングバリアントを包括的に解析する技術が進展しています。