酵素の一種。2本鎖のDNAを切断する。必須因子や切断様式により3種類に大別されるが、そのうちのII型酵素が遺伝子組み換えに多用される。
多様な制限酵素の認識する塩基配列のパターンも同様に多様だが、あるひとつの制限酵素が多くの種類の塩基配列を認識することもあれば、逆にあるひとつの塩基配列を認識する制限酵素に多くの種類があることもある。制限酵素はDNA中にあるそのパターンを認識し、その付近あるいはその配列の内部で切断する。切断された切り口には2種類あり、その形状により平滑末端と粘着末端と呼ばれる。II型制限酵素によって認識される塩基配列のパターンの多くはパリンドローム(回文)になっており、5’端側から読んでも、その相補鎖の5’端から読んでも同じ配列になっている。この酵素の発見によりDNAの加工ができるようになり、遺伝子組み換え実験が可能となった。
また制限酵素は遺伝子組み換えの他にも、制限地図の作成やRFLPの解析にも用いられる。