ご研究の背景

私は、現在、九州歯科大学生化学分野でPIとして研究室を持ち、松原准教授らと一緒に、骨・骨格筋代謝機構の解明と再生医療への応用を目指して研究を進めています。今回のiScience 誌に掲載された論文は、低身長、四肢の低成長、顎顔面の形態異常、脱臼しやすい関節などの症状を有する「脊椎骨端骨幹端異形成症2型（SEMDJL2）」という先天性疾患をテーマにした研究です。SEMDJL2の患者さんでは、ゲノムのエクソーム解析によって、キネシンファミリータンパク質、KIF22の遺伝子にいくつかの点変異（point mutation）があることが確認されていたのですが、これまで病態との関連は解明されていませんでした。私も松原も歯学部出身ですが、長い間、軟骨、骨といった組織を研究してきました。2017年ごろから破骨細胞でKIFファミリーの研究をしており、軟骨細胞の先天性疾患の患者さんでKIFファミリーの遺伝子に変異があったことは、非常に興味を引きました。特に、低身長などのSEMDJL2の病気の症状を知った時に、これは絶対に骨や軟骨などの成長や増殖に何かの特徴があるに違いないと考えたのが、この研究のきっかけです。

今回の論文の内容

今回、iScience誌で発表した論文は、Kif22遺伝子にSEMDJL2患者に相当する変異を導入した時に、マウスの軟骨細胞（chondrocyte cell）でどのような変化が起きるかを明らかにしたものです。

骨が伸びるためには、まず骨の末端近くにある成長板と呼ばれる部位の軟骨が成長しなければなりません。成長板は、静止細胞層、増殖細胞層、肥大細胞層に分かれており、休止帯に存在する骨格幹細胞が軟骨細胞に分化して、増殖細胞層で細胞分裂します。肥大細胞層では、軟骨細胞は次第に大きく丸くなり、やがて骨幹に近づくにつれて軟骨基質が石灰化し、骨組織に置き換わります。そのため、骨の成長と伸長には、軟骨細胞が盛んに分裂し、細胞を供給することが大事なわけです。

私たちは、SEMDJL2患者で長管骨が成長していないという病態から、この軟骨細胞に着目しました。まず、マウス軟骨細胞の前駆細胞株ATDC5細胞で、Kif22遺伝子をshRNA を使用してノックダウンさせたところ、ノックダウン細胞の増殖率がコントロール細胞と比較して大幅に低下していることが観察されました。また、ATDC5細胞にプラスミドを導入し、SEMDJL2 で発生する KIF22変異体（Pro(R)143Leu(Q)）を過剰発現させると、野生型のKIF22を導入した場合にくらべて、細胞増殖が減少していました。このとき、アポトーシスには影響はありませんでした。つまり、KIF22が機能しなくなることで、細胞数が減っているのでなく、軟骨細胞の成長や増殖が悪くなるのでということは、実は割と早い段階で突き止めることができていたのです。

今回の研究では、生後2週のマウスの脛骨成長板の切片を KIF22 抗体を用いた免疫組織化学染色で染色し、KIF22 が軟骨の増殖領域で高発現していることを確認しています。こうした結果を受け、また私たちとしても研究成果のインパクトを出したいということもあったので、次は、培養細胞ではなく、遺伝子改変マウスを作製し、生体から採取した軟骨細胞を試料に研究を進めることにしました。

そこで、CRISPR-Cas9ゲノム編集での点変異マウスの作製を、これまでにも何度かマウス作製を依頼したことがあったセツロテックさんに相談しました。当時の私たちとしては、資金的にはなかなかハードルが高いこともあり、結構頑張った依頼ではあったのですが、かなり勉強していただいたりして、感謝しています。

ただ、KIF22は、キネシンファミリータンパク質、つまり細胞の有糸分裂に関係するタンパク質ですのでこれを欠損させると、卵割から上手くいかず、ほとんどが胎生致死なんですね。セツロテックさんとのやり取りでも、この欠損が致死性の表現型につながる遺伝子であることをお伝えして、予備試験やゲノム編集をしっかりやったうえで、それでも最終的に納品できない可能性があることを承諾したうえでお願いしました。半年後に、セツロテックさんから、片アリルに目的の点変異（R144Q）が確認できたF0世代の2匹のメスを納品してもらいました。これは運次第であることは理解していますが、本当はこれがオスだったらよかったのにとは思いますね。論文のデータを取るためには個体数を増やすことが必要なので、この納品されたメス個体を使って掛け合わせたのですが、やっぱり胎生致死の影響があるようで、全然子供が取れませんでした。ここはかなり苦労し、時間がかかったところです。1匹の点変異マウスは体外受精もしたのですが、やっぱりだめでした。ただ、幸いなことに、松原が気長に半年もかけ合わせたもう1匹のゲノム編集マウス（KIF22ΔC）で子供が取れ、実験に必要な個体数を揃えることができ、これが今回のiScience誌の論文のメインデータとして使っているものです。

透明骨格標本などで観察してみると、KIF22の機能を喪失した遺伝子変異モデルマウスでは、野生型マウスと比べて、足の骨である脛骨の成長板の厚さと骨全体の長さが短くなっていました。これは低身長と四肢短縮というSEMDJL2の特徴と似ていました。また、Kif22変異マウスの肋軟骨から採取した一次軟骨細胞では、野生型マウスに由来する細胞と比較して、細胞の増殖率が有意に低下していることが示されました。興味深いことに、Kif22変異マウス由来の軟骨細胞では、有糸分裂時の異常な紡錘体の形成が著しく増加していることも明らかになりました。キネシンはモータータンパク質の一つで、ATPを加水分解しながら微小管に沿って運動し、細胞分裂や細胞内物質輸送に重要な働きをすることが知られています。つまり、Kif22 遺伝子の変異では、軟骨細胞で有糸分裂時の紡錘体の形成がうまくいかなくなり、細胞増殖が低下していることが示唆されます。

これらの結果から、SEMDJL2患者ではKIF22の遺伝子が変異し、軟骨細胞の分裂に必須の構造である紡錘体が正常に形成されないため、細胞分裂が遅くなり、結果として骨の伸長が妨げられることが考えられました。

なぜセツロテックに外注しようと思ったのか？

埼玉医科大学で、私の兄弟子の福田亨先生と同じラボに所属していた際に色々手ほどきを受けており、ちょうど私たちが独立した後も、福田先生にマウスのことは常日頃相談していました。その時、「ノックアウトマウスを作りたいのですが、良いところを知らないですか？」と聞いたら、ちょうど竹本先生がセツロテックを立ち上げたことを紹介いただいたのがきっかけです。それから、何件かゲノム編集マウス作製を依頼してきました。やはりちゃんとしたマウスを作製してもらったということは、セツロテックを利用するメリットだと思っています。

今後の研究展望

今回の論文がアクセプトされるまでの過程で、レビュアーとのやり取りでいろいろ苦労しましたが、今回の明らかにした知見により、まずSEMDJL2の治療法開発に貢献できるのではないかと考えています。さらに、KIF22は軟骨細胞に多く発現していることから、増殖を制御することで、軟骨をターゲットとした再生医療への展開も期待しています。今回作製したマウス自体は、骨に明らかなフェノタイプが観察されなかったので、研究自体は一区切りとし、今は凍結精子の状態で保存しています。本当におかげ様で、私たちもiScience誌に出せて、プレスリリースして、自他ともに一皮むけることができたなと思っており、本当に感謝していますね。

編集後記

インタビューでは、レビュアーとのやり取りや、納品後のマウス繁殖にご苦労された点など、多くの興味深いエピソードをお聞かせいただきました。
その中で印象的だったのが、ご出身の研究室では細胞への過剰発現が主流だったそうですが、ゲノム編集に移行したが故に当時では考えられなかったレビュアーからの指摘を受け、時代の変化を感じたとお話しされていたのが印象に残りました。ゲノム編集の活用が当たり前となった現在を象徴する実例として、貴重なお話をお聞かせいただき、誠にありがとうございました。

参考論文

1.Kawaue H, et al., KIF22 regulates mitosis and proliferation of chondrocyte cells. iScience. 2024 May 31;27(7):110151.

ご研究の背景

私は現在、徳島大学病院の呼吸器内科に所属し、西岡安彦教授指導のもと主に肺がん、中皮腫といった難治性の胸部腫瘍をテーマに研究しています。徳島大学から同大学院のMD-Ph.D.コースに途中編入して学位を取得したので、学生の頃からずっと徳島で呼吸器病学の研究に取り組んでいます。がんは難治性の疾患であり、苦しまれている患者さんも非常に多いということから、ずっと新規治療法についての高い関心を持っていました。今回のCell Reports誌に掲載された論文も、肺がんや悪性胸膜中皮腫を主なテーマにした研究になります。徳島大学の呼吸器内科領域では、中心的な治療法であるがんの分子標的治療についての先行研究も多く行っていますので、徳島大学病院の呼吸器内科へも所属しながら研究に取り組むことで、臨床現場への橋渡しもできればと考えて、日々研究しています。

現在の肺がん治療において、中心を担う治療のひとつが抗PD-1/PD-L1抗体に代表される免疫チェックポイント阻害薬です。実際の臨床現場では、これに加えて、他の抗がん剤や分子標的治療薬を併用する複合がん免疫療法の開発が進んでいます。特に、血管新生阻害剤（抗VEGF抗体）は、がん細胞へ栄養や酸素を供給するのを阻害し、がん細胞をいわば兵糧攻めにするような治療であり、免疫チェックポイント阻害薬と併用することで抗腫瘍効果が増強されることが報告されてきました。しかし、このメカニズムについて分子レベルでは解明されておらず、治療効果はあるものの具体的にどうして相乗効果が生まれているのか、よくわかっていませんでした。私たちは、このメカニズムを解明することで、患者さんにより効果的な治療ができる新しい複合がん免疫療法の提案につながるのではないかと思い、今回の研究をスタートさせました。

私たちの研究室では、血管新生阻害剤を用いた治療法に関連して、腫瘍内にある線維細胞（fibrocyte）という細胞の研究をしています。今回の論文は、この線維細胞が腫瘍免疫に関わることについて、より詳しく掘り下げていった結果、臨床で使用される複合がん免疫療法のメカニズムの解明につながった成果の報告になります。

私たちの先行研究においては、in vitroにおいて、線維細胞に免疫チェックポイント阻害薬を加えると、T細胞増殖促進能が増強されるという報告をしていました[2]。しかし、この報告では、実際のマウス腫瘍組織内に線維細胞が存在するという直接的な細胞分画の同定は得られていませんでした。そこで、まずマウス皮下に移植した腫瘍内に集まってくる血球細胞（CD45陽性を示す細胞）を回収し、シングルセル RNA-seqを行うことから始めました。2万個ほどの細胞について、その遺伝子発現をコントロール群と血管新生阻害剤（抗VEGF抗体）処理群で比較し、抗VEGF抗体投与時に新たに集まってくる細胞が観察されないか確認したのです。その結果、抗VEGF抗体処理群で腫瘍内に増加する新たな細胞クラスターとして、線維細胞クラスターを同定することに成功しました。また、このクラスターに特異的な発現をしていたCD34を表面マーカーとして、線維細胞クラスターを生細胞として分離することにも成功しました。これにより、今まで具体的な証拠がなかったマウス腫瘍内の線維細胞の存在を示すことができたのです。

もう1点、これはセツロテックさんにノックアウトマウス作製をお願いした理由でもあるのですが、先行研究では、線維細胞に免疫チェックポイント阻害薬を加えた際のCD80やCD86といった共刺激分子の関与は、中和抗体を使ったin vitro の試験でのみ結果が示されていました。in vivoでは実際の生体マウス組織に中和抗体を用いることが困難であるため、深く掘り下げられていなかったのです。そこで、CD80遺伝子とCD86遺伝子をそれぞれ塩基欠損させたノックアウトマウスを作製し、それぞれの共刺激分子の機能を解析することを試みました。

セツロテックさんに依頼したのは、ゲノム編集によるノックアウトマウス作製の一部の工程（編注：ゲノム編集受精卵作製サービス）です。私がお伝えした遺伝子について、セツロテックさんにガイドRNAの設計と、マウス受精卵に対するゲノム編集をしていただき、凍結受精卵を納品していただきました。納品してもらった受精卵については、同じキャンパス内の徳島大学の動物施設等で仮親マウスに移植し、産まれてきたマウスをジェノタイピングしながら掛け合わせることで、最終的にはホモノックアウトマウス（Balb/c系統：CD80-/-およびCD86-/-）をそれぞれ作りました。

これらのノックアウトマウスと野生型マウスの肺由来の線維細胞を採取し、それぞれをレシピエントマウスの持つ腫瘍の皮下近傍に移植して、抗PD-L1抗体の治療効果にどのような影響を及ぼすかを観察しました。論文ではfigure 6に相当する部分ですが、例えばfigure 6Bで示すように、野生型マウスの肺由来の線維細胞を移植すると、腫瘍のサイズが抗PD-L1抗体単独（移植なし）の場合より小さくなりましたが（つまり相乗効果あり）、CD86-/-マウスの肺由来の線維細胞を移植しても腫瘍進展抑制の相乗効果は観察されませんでした。このことは、免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-L1抗体）と、血管新生阻害剤により腫瘍局所に集まってくる線維細胞の相乗効果において、CD86の存在が極めて重要であることを示しています。先行研究でのin vitroの研究でもCD86が重要であることは示されていたのですが、in vivoでもここまできれいに結果が出てくれたのは、このノックアウトマウスを作ってもらったおかげととても感謝しているところです。一方、CD80-/マウスを使った同様の試験により、CD80については、線維細胞と抗PD-L1抗体の相乗効果に大きく関わっていないことが示されました。

今回の論文では、これらの結果と併せて、線維細胞の分化を抑制するTGF-β/SMAD阻害剤の併用についても解析をしています。私たちはこれらの結果を踏まえ、まず、血管新生阻害剤抗VEGF抗体で線維細胞を腫瘍に集積させ、次に免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-L1抗体）との相乗効果でその線維細胞のT細胞活性促進能を増強し、さらにTGF-β/SMAD阻害剤で線維細胞の分化を抑制する、というこの三本柱で投薬治療をすれば、より強い治療効果が得られるのではないかと考えています。

なぜセツロテックに外注しようと思ったのか？

セツロテックさんは、徳島大学内の同じキャンパスにあるということで、噂は少し伺っていました。注文時には、セツロテックさんのこれまでのゲノム編集マウス作製実績も論文で確認し、あとはやはり同じ施設内なので、いろいろと都合がつきそうかなということもありました。隣の建物ですし、そういったご縁もあったかと思います。

セツロテックに頼んで感じたメリット

徳島大学の蔵本キャンパスは、臨床の場である徳島大学病院もあれば、大学としての基礎研究の場所もあり、またセツロテックさんのように大学発ベンチャーもあるので、非常に便利な研究環境であると感じています。今回のノックアウトマウスについても、徳島大学の動物実験施設も近くの建物にありますので、セツロテックさんに作っていただいた受精卵を直接持って行って仮親マウスへ移植するなど、時間と手間のロスがかなり抑えられました。私は、ゲノム編集については専門外だったので、依頼するまでは敷居が高いイメージがありましたが、in vivoで一つの分子の機能の重要性を判断するには、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを使用するしか方法がありませんので、この点で今回は非常に重要な結果を出すことが可能になりました。CD80ノックアウトマウスについては、実はリバイスで指摘されて追加したデータなのですが、ゲノム編集で迅速にマウス作製ができたことで、幸い間に合ってデータを追加することができたのも大変ありがたかったです。

また、セツロテックさんには、F1世代、F2世代作製時のジェノタイピング作業も委託しており、産仔の尻尾のサンプルを送付するだけでしたので助かりました。論文のマテリアル＆メソッドの部分では、文章のテンプレートも提供いただき、それを元に作成しました。

今後の研究展望

今回の論文では、徳島大学病院の外科の先生にもご協力いただき、臨床ヒト検体からのシングルセル解析で、肺がん患者さんからの腫瘍組織にも線維細胞クラスターが存在することを示しています。今回、がんの患者さんへの複合がん免疫療法の効果を左右するのに、線維細胞の存在が非常に重要なのではないかということをお示しできたので、臨床的にはこれが免疫療法の効き目を事前に予測できるバイオマーカーにならないか、ということを期待しています。具体的には、線維細胞を遊走させる分子の血中濃度、あるいは血中における線維細胞の数などを、より鋭敏なバイオマーカーとして使えないかと考えています。また、血管新生阻害剤による抗腫瘍効果の増強メカニズムを明らかにできたことで、線維細胞の機能をターゲットにした新しい複合がん免疫療法の戦略を提示できるのではないか、新規治療の開発に結び付けていけるのではないか、こうしたところを期待して、現在も研究を発展させています。

セツロテックへの要望

ガイドRNAの作製はゲノム編集の初心者には大きなハードルであり、ノウハウがなければ困難でした。非常によくしていただき、ありがたかったです。敢えて要望を申し上げるならば、設計の際に、設計の理由や用語などをレポートなどで教えていただけたら、より理解が深まったかと思います。また、マウス作製に関する図などをご提供いただけると、よりきれいに論文が作れるのではないかと思います。

取材後記

三橋先生の今回のご研究は、これまでin vitroの試験でしか示すことができなかった結果が、ゲノム編集技術でノックアウトマウスを作製することで、in vivoでも実に明確なデータとして示されており、非常に興味深いご報告であると感じました。肺がんは、苦しまれている患者さんの多い病気です。我々がお手伝いできた先生のご研究の成果が、臨床現場の患者さんまでつながることを期待しています。

参考論文

1.Mitsuhashi A, et al. Identification of fibrocyte cluster in tumors reveals the role in antitumor immunity by PD-L1 blockade. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112162.
2.Afroj T, Mitsuhashi A, et al. Blockade of PD-1/PD-L1 pathway enhances the antigen-presenting capacity of fibrocytes. J Immunol. 2021 Mar 15;206(6):1204-1214.

培養細胞からノックアウトマウスの解析へ

私は薬学部出身で、学位を取るときには細胞実験をしていました。細胞実験では、薬剤を投与すると何らかの活性が変化したり、細胞の形状や増殖が変化したりすることは確認できます。しかし、細胞実験では個体レベルでの変化をとらえることは困難です。そこで、当時に登場したノックアウトマウスを作製して、生体における遺伝子機能の解析を始めることにしました。現在は、生体内におけるイオウの代謝が研究テーマです。

隣接するイオウ転移酵素遺伝子は解析するのは困難

古来より毒ガスとして知られている硫化水素（H2S）は、現在では一酸化窒素と一酸化炭素に続く第3の生理活性ガスとして注目されています。H2Sや硫黄分子が付加された活性硫黄分子種を産生する酵素として、3-メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素（MPST: 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase）とチオ硫酸イオウ転移酵素（TST: thiosulfate sulfurtransferase）などがあります。MPSTは3-メルカプトピルビン酸を、TSTはチオ硫酸化合物を基質にすることが、生体外での試験管内の実験から明らかになっていますが、生体内での機能や生理学的意義は不明のままです。

生体内における酵素の機能を明らかにするには、その酵素をコードする遺伝子の機能を欠損させたマウス（ノックアウトマウス）での解析が有効です。これまでに、国内外で、相同的組換えによって作製されたMpstとTstの機能欠損マウスが報告されています。しかし、MpstとTstは、染色体上で隣り合わせに位置するホモログであるため、ノックアウトマウスの作製には注意が必要です。例えば、Tstノックアウトマウスでは隣のMpstのプロモーター領域まで欠損している可能性がありました。また、Mpstノックアウトマウスでは、Mpstの活性は確かに失われたものの、一方でTstの発現が上昇して機能的には代償されてしまったことが報告されています。Mpstの機能を欠損させ、かつ隣接するTstの発現などに影響を与えないようにするためには、遺伝子改変領域を限局する必要があると考えました。それには、ゲノム編集しか方法がありません。

そこでセツロテックに、Mpstノックアウトマウスの作製を依頼しました。エキソン2を標的に、3系統において機能欠損を確認できたので、このノックアウトマウスを用いて解析を行うことにしました。

ゲノム編集によるノックアウトマウスで熱産生の異常を発見

まず、Mpst KOマウスにおいて我々が懸念していたことである、Tstの発現への影響を検証しました。MpstとTstは、いずれもほぼすべての臓器で発現します。今回は比較的両遺伝子が強く発現する肝臓や腎臓などにおいて、ウェスタンブロッティングでそれぞれのタンパク質の発現量を確認したところ、ゲノム編集によるMpstノックアウトマウスでは、MPSTの発現がほぼ消失していたのに対して、TSTの発現量は野生型と比較して変化は見られませんでした。また、ノックアウトマウスでは、3-メルカプトピルビン酸の代謝についてMPST活性がほぼ失われていることが確認できました。

次に、ゲノム編集によるMpstノックアウトマウスでは、3-メルカプトピルビン酸の酸化物とシステインとの結合物が尿中に蓄積していることがわかりました。ヒトでは、MPST機能欠損によって同様の病態があることから、今回のノックアウトマウスはヒトの遺伝性疾患のモデルマウスになる可能性が示されました。

MPSTが産生するH2Sは、ミトコンドリアにおいて熱酸性に関係していることが最近注目されています。そこで、今回のノックアウトマウスにおける熱産生について検証しました。野生型マウスでは、受動的全身性アナフィラキシーを引き起こすと、直腸体温が一過的に低下します。ところが、Mpstノックアウトマウスでは、体温低下がより大きく、その回復も遅れるという有意な変化が見られました。他の硫化水素産生酵素であるcystathionine γ-lyase（Cth） ノックアウトマウスでは体温低下の増悪化が認められなかったため、ミトコンドリアにおけるMPSTは、体温調節に関与している可能性が示唆されます。こうしたことは、細胞での試験や試験管内の試験ではわからず、ノックアウトマウスを用いた表現型解析だからこそわかることです。

今後の研究展望

この成果を発表した後、セツロテックにTstノックアウトマウスと、Tst/Mpst ダブルノックアウトマウスの作製を依頼しました。現在は繁殖中であり、熱産生についてTSTとMPSTがどのように関わっているのか調べていきたいと考えています。

また、そもそもTSTとMPSTは、植物に含まれる青酸配糖体の分解物である有毒なシアン化物にイオウを転移することで無毒化できると生化学の教科書には記載されています。しかし、両酵素が生体内で本当にシアン化物の解毒のために作用していることを実証した報告はありません。我々は、生体内で有益な作用を有するH2Sや活性硫黄分子種を産生するために、イオウ転移作用があるTSTとMPSTが存在するのではないかと考えています。熱産生も含め、TSTとMPSTの生理学的意義を探ることが今後の目的です。

セツロテックへの要望

KOマウスの作製は通常の研究室では難しいと思います。それを委託できるのは、時間やコストの面において大きなメリットがあります。進捗状況を逐一報告していただけるので安心感もあります。セツロテックには2回依頼していますが、着実に技術が上がっていると思います。

要望があるとすれば、納品するマウスがデフォルトの契約では2匹となっていますが、価格を上げてでも5匹くらいに増やすのがよいかと思います。ノックアウトマウスは、作製することも重要ですが、納品されたマウスを増やすことも重要です。繁殖には半年くらいかかりますが、うまく繁殖できない可能性もあります。我々は、繁殖が失敗する可能性があることを理解しているので、今回は全数納品を希望しましたが、ノックアウトマウスに詳しくない方ほど落とし穴になるかもしれません。繁殖にはまず雄を試すなど、詳しくない方向けに細かい情報を出すと親切かと思います。

取材後記

石井先生は、「これまでさまざまなノックアウトマウスを作製してきましたが、予想できたことを証明するよりも、予想外のことを見つけることのほうが楽しいです」と、基礎研究ならではの面白さも語っていました。仮説検証のみならず、新たな発見につながるよう、今後も当社はノックアウトマウスの作製とさらなる技術開発に取り組みます。

慢性骨髄性白血病の再発とがん幹細胞

慢性骨髄性白血病（CML: chronic myelogenous leukemia）は、かつては不治の病でしたが、2001年に原因遺伝子産物BCR-ABL1を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤（TKI: tyrosine kinase inhibitor）が開発されたことで患者さんの治療は劇的に改善しました [2]。そして、現在では、どのようにしてTKI治療後の再発を克服するかが重要な課題となっています。これまでに、TKI の治療により寛解状態を維持した患者さんで治療を中止してみるという臨床研究が行われていますが、およそ半数の患者さんでは根治しており、残りの患者さんでは再発が起こることが報告されています [3]。

近年、このようなCMLの再発の原因となる細胞として、CML幹細胞の存在が知られています。CML幹細胞は、CML細胞を生み出すもとになる細胞です。その一方で、CML幹細胞自身は増殖活性が低い「休眠状態」を維持することで、長期間の維持能力やTKI抵抗性を獲得しています。TKIは、増殖活性の高いCML細胞に治療効果を示しますが、CML幹細胞は増殖活性が低いためTKIが作用しにくいと考えられています。そのため、TKI治療をおこなってもCML幹細胞が生存し続け、再発の原因になるとされています。

そこで私たちは、CML幹細胞の生存維持や休眠状態の制御に関わるメカニズムを解析し、CML幹細胞をターゲットとする新しい治療法の研究をおこなっています。

CML幹細胞ではリゾリン脂質酵素の発現が亢進している

私たちは、以前、CMLのマウスモデルを構築し、CML幹細胞を分離することに成功しました [4]。このCML幹細胞においてRNA-Seqにより遺伝子発現プロファイルを解析しました。そして、CML幹細胞ではリゾリン脂質代謝を行うGdpd3が強く発現していることを見いだしました。一般に、リン脂質は2本の脂肪酸を持つのに対して、リゾリン脂質は脂肪酸を1本しかもたないためリン脂質に比べて親水性が高く、それ自身生理活性を有すると考えられています。Gdpd3は、このようなリゾリン脂質を加水分解してリゾホスファチジン酸（LPA: lysophosphatidic acid）を産生する酵素として報告されています。しかし、なぜ、CML幹細胞はGdpd3を高発現しているのか、リゾリン脂質の役割はこれまで明らかでありませんでした。

そのような時、研究室にセツロテックの担当者様がお見えになられ、私たちはGdpd3ノックアウトマウスの作製を決断しました。この運命的な出会いにより、これまで未知のCML幹細胞におけるGdpd3研究へのチャレンジが始まりました。

Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞は休眠状態を維持できない

当初、生まれたGdpd3ノックアウトマウスに目立った異常はありませんでした。しかし、それは、幹細胞の研究を行うときにはよくあることです。生体内において非常に少数しか存在しない幹細胞において、その特異的な制御に関わる機重要な分子ほど、表面的な特性は見えにくいものです。また、もしも、がん幹細胞に特異的なメカニズムを見つけることができれば、副作用が少ない治療方法となることを暗示しています。私たちは、早速CML幹細胞の連続移植を行い、機能評価を開始しました。Gdpd3ノックアウトマウスと、比較対象として野生型マウスから造血幹細胞を取り出し、BCR-ABL1遺伝子を導入して移植（1次移植）を行いました。私は、もしかすると、Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞は、その機能が低下して、CMLを発症しなくなるのではないかと予測（期待）していました。しかし、結果は真逆で、Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞では、野生型マウス由来のCML幹細胞に比べて白血病発症能が高く、全てのマウスが先に死亡してしまいました。このことは、Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞は休眠状態を維持できず、増殖活性が高くなっていることを示す結果ですが、それと同時に、長期間の幹細胞性の維持能力が低下していることを示唆する重要な結果でもあります。このことを証明するため、1次移植マウスからCML幹細胞を純化して別の野生型マウスに移植（2次移植）を行うと、（今度は予想どおり）Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞ではCML発症能がほとんど失われていることがわかりました。実際に、BrdUのパルスラベルによってCML幹細胞の増殖能について調べると、BrdU陽性で示される細胞周期のS期の細胞が有意に多く見られました。これらの結果から、Gdpd3遺伝子が欠損することでCML幹細胞の増殖能が亢進し、休眠状態が維持できないことが証明されました。

さらに、Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞では細胞増殖を促すAKT/mTORC1パスウェイが活性化していることや、CML幹細胞の維持に関わるFoxo3aの活性が低下していることもわかりました。

最後に、CML幹細胞に対するTKI抵抗性を評価した結果、Gdpd3ノックアウトマウス由来のCML幹細胞を移植したマウスではTKI（ダサチニブ）を投与した後の再発が低下することがわかりました。これらの結果から、Gdpd3によるリゾリン脂質代謝はCML幹細胞の生存維持に必須な役割を担っており、Gdpd3遺伝子の欠損によりCML幹細胞の休眠状態が維持できなくなってTKI抵抗性が低下することが明らかになりました。

今後の展望

これまで、多くを占めるCML細胞ではBCR-ABL1などによるオンコジンに依存的なメカニズムによって増殖能を獲得していることが知られています。抗がん剤による治療ではこの増殖活性を抑制することで治療効果が得られます。しかし、CML幹細胞では、オンコジン非依存的なメカニズムによって休眠状態を獲得しており、そのため抗がん剤による治療を難しくしています。今回、私たちはGdpd3によるリゾリン脂質代謝パスウェイによるCML幹細胞の休眠メカニズムの一端を解明することができました。

今後、Gdpd3を阻害する分子標的薬を開発できれば、TKIと併用することでCML患者の再発を改善できる可能性があります。また、他のがんのがん幹細胞においてもGdpd3によるリゾリン脂質代謝の機能解析を行いたいと考えています。オンコジン非依存的なリゾリン脂質代謝を標的とする新しいコンセプトのがん再発治療の開発につながればと思います。

セツロテックへの要望

セツロテックでのノックアウトマウスの作製では、依頼してから届くのに約4カ月と早く、すぐに解析に取り掛かることができました。これはセツロテックの品質と社員の皆様の誠実なご対応の賜物と考えています。ノックアウトマウス作製は他に替えがたい価値があり、今後も研究を継続していきたいと考えております。

また、遺伝子改変マウスの樹立はゲノム編集の技術が最も活かされる領域と考えています。今後、floxマウスの樹立など、ゲノム編集技術のアドバンテージを活かした遺伝子改変マウス樹立の開発をすすめていただけたらと思います。

取材後記

ノックアウトマウスを用いた解析といえば表現型を観察することが多いのですが、遺伝子欠損のがん幹細胞を単離して病態モデルマウスを作製するというユニークなアプローチを採用しているのが印象的でした。

＜参考文献＞

1. Naka K, Ochiai R, Matsubara E, et al. The lysophospholipase D enzyme Gdpd3 is required to maintain chronic myelogenous leukaemia stem cells. Nat Commun. 2020; 11(1): 4681.
2. Kantarjian H, O’Brien S, Jabbour E, et al. Improved survival in chronic myeloid leukemia since the introduction of imatinib therapy: a single-institution historical experience. Blood. 2012; 119(9): 1981-1987.
3. Mahon FX, Rea D, Guilhot J et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncol. 2010; 11: 1029-1035.
4. Naka K, Hoshii T, Muraguchi T, et al. TGF-b-FOXO signalling maintains leukaemia-initiating cells in chronic myeloid leukaemia. Nature. 2010; 463(7281): 676-680.

歯周炎治療薬のエリスロマイシンには抗菌以外の作用がある

私はもともと歯科医で、今でも日本にいるときは臨床の現場に立ちながら研究を行っています。「日本にいるときは」としたのは、今は新潟大学だけでなく米国ペンシルベニア大学でも准教授のポストについており、昨年（2019年）からは科研費の一環で国際共同研究のためにペンシルベニア大学で研究をしています。

本来であればすでに日本に帰国している予定でしたが、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の影響で現在（2020年9月時点）も米国に滞在しています。今回『JCI Insight』誌に掲載された論文は、新潟大学で取り組んでいた内容を発表したものです。

私の大きな研究テーマは歯周炎です。歯周炎は、歯茎の炎症が歯を支える構造にまで広がる疾患で、骨が破壊され、やがて歯が抜ける状態に至ります。歯周炎の薬物治療として、歯周炎の原因となる細菌を除去するために、マクロライド系抗菌薬であるエリスロマイシンが使用されています。

一方で、マクロライド系抗菌薬は抗菌作用だけでなく、免疫調節作用や炎症抑制作用があることが報告されています。その一例に、COVID-19の肺炎症状を改善したという臨床報告もあります。さらに、マクロライド系抗菌薬は感染症ではない疾患、例えば嚢胞性線維症や慢性閉塞性肺疾患（COPD: chronic obstructive pulmonary disease）の治療にも使用されています。

しかし、マクロライド系抗菌薬がどのように炎症抑制作用を発揮しているのか、詳細は不明でした。

エリスロマイシンはDEL-1の発現上昇と炎症抑制を誘発する

マクロライド系抗菌薬が炎症抑制作用を有する理由として考えられてきたのが、好中球による炎症を抑えているのではないか、ということです。

好中球の遊走を阻止する分子として、血管内皮細胞で発現するdevelopmental endothelial locus-1（DEL-1）タンパク質が知られています。DEL-1は、好中球がもつインテグリンに対して拮抗するため、好中球の血管外への遊走を阻止することで炎症を抑制します。以前に私たちは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を引き起こしたマウスにおいて、脳に好中球が到達しないようにすると炎症を抑えることを報告しました。また、サルにおいても、DEL-1は炎症性の骨吸収を抑制することを報告しました。

そこで私たちは、マクロライド系抗菌薬であるエリスロマイシンはDEL-1の発現を誘導することで炎症抑制作用を発揮するのではないか、と仮説を立てました。

細菌の内毒素であるリポ多糖（LPS: lipopolysaccharide）を用いて実験的に肺炎を起こしたマウスにエリスロマイシンを投与すると、肺組織においてDEL-1の産生、さらに好中球の減少と肺胞の改善が認められました。致死性の量のLPSを用いた場合には、エリスロマイシンの投与により生存率の改善も認められました。これらの改善は、他のマクロライド系抗菌剤であるペニシリンやジョサマイシンでは観察できなかったので、エリスロマイシン特有の作用であることが明らかになりました。

同様の改善は、歯周炎でも認められました。歯茎に糸を巻きつけて歯肉炎を再現したマウスに対してエリスロマイシンを投与すると、炎症抑制、骨の溶解量の抑制が認められました。これらもペニシリンとジョサマイシンでは見られませんでした。

以上の実験はすべて野生型マウスで行ったものですが、エリスロマイシンがDEL-1依存的に炎症抑制作用を発揮していることを示すためには、DEL-1ノックアウトマウスにおいてエリスロマイシンが炎症抑制作用を発揮できないことを示す必要があります。そこで、セツロテックにDEL-1ノックアウトマウスの作製を依頼しました。

ノックアウトマウスが論文の質を高めてくれた

ノックアウトマウスは劣性致死を懸念していましたが、幸いにもDEL-1ノックアウトマウスは生存してくれました。そして、LPSによる肺炎モデルを作製すると、DEL-1ノックアウトマウスではエリスロマイシンを投与しても好中球の減少や肺炎の改善、生存率の向上が認められませんでした。歯周炎マウスにおいても同様に、DEL-1ノックアウトマウスではエリスロマイシン投与による病態改善は認められませんでした。

以上のことから、エリスロマイシンはDEL-1の発現誘導を介して、肺炎や歯周炎における炎症抑制作用を発揮することを明確に証明できました。

ノックアウトマウスによるデータがあるのとないのとでは、論文の質が大きく変わると思います。エリスロマイシンの炎症抑制作用がDEL-1を介していることを示すためには、ノックアウトマウスを用いた実験が必要不可欠でした。ノックアウトマウスによるin vivoのデータがあると説得力があります。

論文ではその後、詳細な経路解析を行いました。その結果、エリスロマイシンは成長ホルモン分泌促進因子受容体（GHSR: Growth hormone secretagogue receptor）に作用してDEL-1の発現を誘導することを明らかにしました。

実は論文の投稿時、レビュワーから「GHSRのノックアウトマウスで検証したらどうか」という意見がありました。今回はそこまで検証できませんでしたが、やはりそれくらいノックアウトマウスは重要だと改めて感じました。

今後の展望

本研究の応用として、DEL-1を標的とした抗炎症薬、骨の再生薬の開発につなげたいと考えています。DEL-1は加齢により発現量が減少することがわかっており、それが一因となって炎症が起きやすく、そして骨が溶けやすくなると考えられています。私たちは臨床試験を行い、エリスロマイシンを投与してDEL-1の発現量や骨の密度の変化を調べたいと考えています。

ただ、その際、エリスロマイシンが抗菌薬ということで、耐性菌が懸念されます。そこで私たちは、抗菌性をもたないエリスロマイシンの改変体の中からDEL-1誘導薬を見つける研究も進めています。

また、DEL-1は骨の吸収抑制に関与するので、DEL-1ノックアウトマウスの骨に関する表現型解析も進めており、非常に興味深い結果が得られています。その一部については、もうすぐ論文として投稿しようと考えています。

セツロテックへの要望

セツロテックにDEL-1ノックアウトマウスの作製を依頼したときに助かったことは、ガイドRNAの設計を担当してくださったことです。私たちはマウスやゲノム編集の専門家ではないので、ガイドRNAの設計など、CRISPR/Cas9について詳しいわけではありません。私たちが参考論文を送り、それに準じて設計してくださったのはとても助かりました。受託サービスを利用する人は、基本的に詳しくないから利用するので、ガイドRNAの設計も担当することをアピールしてもよいと思います。利用する側も安心して依頼できます。

今回の論文では、ノックアウトマウス作製方法について、Methodsでセツロテックの論文2報を引用しました。ただ、現在は論文記載用のテンプレートを用意しているとのことなので、次回からはそのテンプレートを活用したいと思います。

なお、価格も安いと思いました。日本に帰国したら、DEL-1のドメインごとに欠損させたノックアウトマウスの作製を依頼したいと考えています。また、2017年に依頼したときはFloxマウスの作製は受け付けていなかったのですが、今は依頼可能とのことなので、いずれ相談させてください。

取材後記

前川准教授には、ノックアウトマウスを使用することで論文の質が高くなることを語っていただきました。海外にもノックアウトマウス作製サービスを提供する企業が多くありますが、前川准教授が最後に「私は日本企業を応援しています」とおっしゃってくださったことは、セツロテックにとって大きな励みとなりました。

セツロテックでは、ノックアウトだけでなく点変異、ヒト化マウス（マウスタンパク質の遺伝子配列をヒトの配列に置き換えたもの）の作製も請け負っています。ぜひご相談ください。

＜参考文献＞
Erythromycin inhibits neutrophilic inflammation and mucosal disease by upregulating DEL-1.
Maekawa T, Tamura H, Domon H, Hiyoshi T, Isono T, Yonezawa D, Hayashi N, Takahashi N, Tabeta K, Maeda T, Oda M, Ziogas A, Alexaki VI, Chavakis T, Terao Y, Hajishengallis G.
JCI Insight. 2020 Aug 6;5(15):e136706. doi: 10.1172/jci.insight.136706.