培養細胞について

培養細胞のゲノム編集について、純化ステップの細胞を選び出す作業は具体的にどのように行うのでしょうか。
純化ステップの細胞を選び出す作業は、接着細胞と浮遊細胞で異なります。
接着細胞の場合、純化ステップは基本的にクローニングシリンダーによるシングルコロニーのピックアップを行います。
弊社独自技術のVIKING法では、遺伝子のノックアウト・ノックインには、主に抗生剤耐性遺伝子の挿入を伴うため、コロニーのピックアップが可能です。
また、耐性遺伝子の代わりに、蛍光タンパク質を用いることもでき、その場合にはFACS(セルソーター)による細胞の分取も可能となります。
浮遊細胞の場合、限界希釈法かシングルセル分注機(MICROJET Single Cell Printer)を使用してピックアップします。
上記の選別したコロニーからゲノムDNAを抽出し、サンガー法によるシーケンシングで、ゲノム編集による変異を確認します。

参考文献

  1. Hashimoto, M. and Takemoto, T*. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Sci. Rep. 5, 11315; doi: 10.1038/srep11315 (2015).
  2. Hashimoto M, Yamashita Y, Takemoto T*.Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev. Biol. 418: 1-9 (2016).
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