将基因编辑引入动物个体的受精卵电穿孔方法是由德岛大学发育生物学家竹本老师和他的同事发明的。 在此，我们将介绍这项在医学、工程等各个领域都有重大贡献的新技术发展情况，以及它发展的时代背景。

竹本老师的故事

沉迷于化学的硕士生竹本龙也遇到了近藤敏人教授（大阪大学大学院生命机能研究科 形态形成研究室），并决定改学生物专业。 他决定主攻生物学，在形态发生实验室，他参与了发育生物学，特别是动物胚胎发生的研究。 胚胎发育是一个极其复杂的过程，涉及各种生物现象和反应。虽然青蛙和斑马鱼是发育生物学领域使用的动物之一，但他的研究是从小鸡胚胎开始的，后来又以小鼠胚胎为研究对象，2005年获得博士学位，之后在大阪大学担任助教，2013年调入德岛大学。

他还发现了震惊世界的 “体轴干细胞 “。(1)传统的胚胎发育理论认为，胚胎分叉为外胚层、中胚层和内胚层，神经系统和表皮由外胚层发育，肌肉和骨骼由中胚层发育。 相反，竹本等人从分析Tbx6基因缺失的小鼠中发现了有从神经系统和主要的中胚中发育成的 “体干细胞 “的存在，体干细胞会发育成神经系统和主要的中胚层。虽然传统的理论是建立在1920年以来两栖动物胚胎研究的理论基础上的，但可以说，分子生物学方法已经验证了古典时期的发育生物学问题。

CRISPR/Cas9与电穿孔

为了利用CRISPR-Cas9系统获得突变个体，竹本与大阪大学助理教授桥本昌和及其同事合作，共同攻克要解决的问题。
竹本和他的同事将开发一种方法，通过电穿孔而不是显微注射将Cas9蛋白和gRNA等基因组编辑工具引入受精小鼠卵子中。

节郎科技的技术/受精卵电穿孔法

其他公司的（传统）技术/显微注射法

在细胞上施加一定的电流，就可以在细胞膜上打一个暂时性的孔，将药物、外来基因、蛋白质等引入细胞内部的方法称为电穿孔。 由于担心对受精卵的损伤，传统的电穿孔法一直没有得到广泛的应用。 提高电压会使孔扩大，但会破坏细胞，导致细胞死亡，而降低电压则会降低基因导入的效率。
然而，通过调整条件的设置，竹本等人成功地将对细胞的损伤降到最低，并提高了基因组编辑因子的引入效率，获得优秀的研究结果(4)。
此外，这种方法不仅可以用于基因破坏，而且还可以通过共同引入单链寡核苷酸（ssODNs）来敲入目标序列。

最初，在竹本、桥本等人的研究中，通过电穿孔引入了Cas9 mRNA和gRNA。 然而，在这种方法中，引入Cas9到受精卵和Cas9蛋白的表达之前胚胎发育已开始进型，导致可能产出高机率的镶嵌体胚胎.(4)。因此，我们成功地建立了一个Cas9蛋白和gRNA可以直接引入受精卵实验系统。 因此，在受精卵从一个细胞分裂到两个细胞前后进行基因组编辑，使得获得镶嵌性的突变体的机率降低。 由于其具有基因组编辑效率高、镶嵌度低的特点，可以说是在某些情况下实现F0代基因功能验证的技术，有望成为体内基因功能分析的有力武器。

哺乳动物的卵上覆盖着一种叫做透明体的糖蛋白基质，有比较高的相似度。为了确定在小鼠中建立的实验系统是否可以应用于其他哺乳动物，竹本与德岛大学的音井威重教授及其同事合作，利用猪受精卵进行了实验(6)。
结果表明，尽管条件需要微调，电穿孔法能够在猪身上进行高效的基因组编辑。

由于猪受精卵因色素沉淀而不透明，因此，猪受精卵的显微注射比一般的小鼠显微注射法需要更高难度的技术。 在这方面，电穿孔法使受精卵的导入可以忽略色素，可以说受精卵电穿孔法(GEEP法)是一项有用的技术，它建立了一种不需要熟练技术的手法。

节郎科技的诞生!

在我们发表了关于创建基因编辑小鼠的研究成果（参考文献4）(4)后，我们收到了许多大学研究人员的联合研究请求。 我们已经进行了几十项联合研究，并负责制造基因编辑小鼠，我们认为，如果我们收到这么多的邀约，将技术提供给制药公司等行业也是有可能的。 我们还认为，可以通过提供一个可以方便联系的委托联络点能够更有效地提供大学研究人员的要求。 因此，于2017年2月，竹本等人成立了节郎科技公司，目的是为基因组编辑技术提供一个快速、易使用的环境，使其不仅适用于实验室，今后也适用于各个行业。

节郎科技利用新开发的技术和过去的经验，进行基因组编辑相关的分析，并支持模型动物的创建。 此外，通过建立高效生成易位、倒位、缺失、重复等各种染色体修饰的技术，节郎科技将为创造各种转基因动物奠定技术基础，为研究人员和产业界提供高通用性的基因组编辑技术。

电穿法实际操作照片

M.L

(1) Takemoto, T.; Uchikawa, M.; Yoshida, M.; Bell, D. M.; Lovell-Badge, R.; Papaioannou, V. E.; Kondoh, H. Tbx6-Dependent Sox2 Regulation Determines Neural or Mesodermal Fate in Axial Stem Cells. Nature 2011, 470 (7334), 394–398.
https://doi.org/10.1038/nature09729
(2) Doudna, J. A.; Charpentier, E. The New Frontier of Genome Engineering with CRISPR-Cas9. Science 2014, 346 (6213). https://doi.org/10.1126/science.1258096.
(3) Hsu, P. D.; Lander, E. S.; Zhang, F. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell 2014, 157 (6), 1262–1278.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.010.
(4) Hashimoto, M.; Takemoto, T. Electroporation Enables the Efficient MRNA Delivery into the Mouse Zygotes and Facilitates CRISPR/Cas9-Based Genome Editing. Sci Rep 2015, 5 (1), 11315.
https://doi.org/10.1038/srep11315.
(5) Hashimoto, M.; Yamashita, Y.; Takemoto, T. Electroporation of Cas9 Protein/SgRNA into Early Pronuclear Zygotes Generates Non-Mosaic Mutants in the Mouse. Developmental Biology 2016, 418 (1), 1–9.
https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.07.017.
(6) Tanihara, F.; Takemoto, T.; Kitagawa, E.; Rao, S.; Do, L. T. K.; Onishi, A.; Yamashita, Y.; Kosugi, C.; Suzuki, H.; Sembon, S.; Suzuki, S.; Nakai, M.; Hashimoto, M.; Yasue, A.; Matsuhisa, M.; Noji, S.; Fujimura, T.; Fuchimoto, D.; Otoi, T. Somatic Cell Reprogramming-Free Generation of Genetically Modified Pigs. Sci Adv 2016, 2 (9). https://doi.org/10.1126/sciadv.1600803.