2020年11月，德岛大学的刑部敬史教授所领导的團隊利用Microcystis aeruginosa衍生的CRISPR I-D（Microcystis aeruginosa TiD：MaTiD）进行植物基因编辑的研究结果发表在《Communication Biology》上[1]。 本文将对刑部教授研发的TiD技术与CRISPR/Cas9等目前基因编辑的主要技术进行对比介绍。

CRISPR/Cas技术和挑战

CRISPR/Cas9為現今主流的基因編輯技术，也是節郎科技的主要技术。
CRISPR/Cas9是由Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna开发的技术，被称为继TALEN和ZFN之后的第三代基因编辑工具。
两位開發此技術教授的论文[2]中解释说，CRISPR/Cas系统是最初存在于细菌和古菌中适应性免疫系统之一，CRISPR RNA（crRNA）和反激活RNA（tracrRNA）形成复合物，并将Cas蛋白诱导到目标序列上和序列特异使DNA裂解”。

首先，CRISPR/Cas系统可以分为两大类。 此外，还发现每一类都有许多亚型，第1类分为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，第2类分为Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型（表1）。

其中，前面提到的CRISPR/Cas9被归为第2类的Ⅱ型[3]。 此外，最近作为一种新的基因组编辑工具而备受关注的CRISPR/Cas12a被归为第2类的V型。
现今主要的基因编辑技术为第2类CRISPR/Cas系统。 特别是CRISPR/Cas9使基因編輯的效率大幅的提升，在基因生物学的进展中扮演了非常重要的作用。利用电穿孔法创建的基因敲除小鼠以及传染病和癌症的研究，其所涉及的领域层出不穷［4］［5］［6］。

另一方面，CRISPR/Cas9也被指出了各种问题。其中最重要的是存在脱靶效应。 脱靶效应是由於CRISPR/Cas9的gRNA序列错置的耐受性切割与原目的不同的靶点，导致不可逆基因突变的现象[7]。 最近发现这种脱靶效应在CRISPR/Cas9中引起不需要的染色体突变，其频率比以前所假设的要高[8]。因此，出现了各种利用机器学习和深度学习的工具，试图更准确地预测目标gRNA。 但是，这些工具仍然存在很多挑战，还没有完全解决脱靶效应的问题。
近年来，人们对於在细菌免疫系统的主要部分–1类的CRISPR/Cas应用进行了探索。 I类作为细菌免疫系统的主要类型，虽然到目前为止还没有被广泛用于基因编辑中，但由于发现1类I-E亞型（Cas3）在哺乳动物中可引起多种基因缺陷，因此逐渐开始引起人们的关注[10]。

這回發表論文的刑部教授確定了在1類中的I-D亞型CRISPR/Cas系统的基因位点，并将该系统的主要蛋白命名为CRISPR typeI-D關聯蛋白質（TiD）。

关于I-D型(TiD)

首先，我们表征了CRISPR typeI-D相关蛋白（TiD），该蛋白被归为1类I型。TiD由Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d和Cas10d五个蛋白复合物所组成，并有5′-GTA-3 ‘、5′-GTC-3’和5’-GTT-3’的3種PAM序列。 此外，gRNAs的靶向序列超过30个碱基，比Cas9(gRNA靶标是20个碱基序列)更具特异性。
而这个TiD结构最重要的特点就是以Cas10d作为DNA的裂解因子。
首先，1类I型CRISPR系统包含一个名为 “CRISPR associated complex for antiviral defense （Cascade）”的Cas亚基复合物和一个靶DNA切割的領域（核酸酶域）。 在大多数I類的亚型中，核酸酶域包含在Cas3内，gRNA与靶的DNA的结合诱导并激活Cas3使標的DNA裂解。 然而，TiD虽然本身具有Cas3蛋白，但缺乏Cas3中的核酸酶域。取而代之的是具有核酶域结构的Cas10d。
此外，识别PAM序列的主要因素之一Cas8的同源蛋白在TiD中也存在缺陷。因此，通过TiD中的PAM序列所识别的目标DNA裂解系统被认为与其他I型系统有所不同。
下表比较了TiD与CRISPR/Cas9和Cas3系统的特点（表2）。

由于上述特点，TiD与传统的基因编辑技术中以Cas9或Cas3作為核酸酶域的技术相比，脱靶效应大大降低。这意味着如果能诱导靶DNA裂解，所产生的细胞或个体就有很高的概率表达性状。

刑部教授等利用西红柿进行的TiD研究

在此想介绍一下本文开头所提及的刑部教授对植物基因编辑的研究以作为TiD上述特性的基础。

在确定了Cas10d蛋白是TiD中的功能性核酸酶后，刑部教授和他的同事们研究了利用该蛋白编辑西红柿细胞的基因。

因此，他们首先利用TiD对人体细胞的基因编辑进行了评估。 刑部教授團隊利用世界各国於人胚肾细胞实验中用到的HEK293(Human Embryonic Kidney cell)进行实验，结果表明Cas3d/Cas10d都是激發TiD活性所必需的。此外，在刑部教授及其團隊[11]之前的研究中，使用TiD表达载体对HEK293中的人EMX1基因（编码参与脑发育的转录因子）进行了基因编辑，在PAM序列前后进行了indels（小的插入/删除），证实长链基因缺失突变可以進行诱发。

接下来，刑部教授及其团队设计了一个带有植物细胞特异性启动子的TiD表达载体，并将其与gRNA一起整合到西红柿细胞这一植物中。gRNA以SlIAA9和SlRIN基因的序列为目标。使用Cel-1(*1)、PCR-RELP(*)和基因测序進行分析。

*1 Cel-1：在目标序列附近扩增DNA后，使用Cel-1酶检查错配位点基因组变异的技术。
*2 PCR-RELP：利用限制性酶切割的DNA片段长度因體而异(=多态性)的技術；通过PCR扩增DNA断裂和限制性酶切割反应产物，可以检查是否发生了基因突变。

结果，他们能够在西红柿细胞以及人类HEK293细胞中诱导出目标基因上的吲哚和长链基因组缺失。至于长链基因缺失突变方面，与CRISPR/Cas9突变相反，发现这些缺失是从靶位点双向发生的。

刑部教授团队还分析了TiD的脱靶效应。
他们将TiD和CRISPR/Cas9应用于拟南芥和水稻的整个基因区域，此外还应用于西红柿4号和5号染色体以及SlIAA9和SlRIN基因区域，并评估了脱靶效应。

结果显示，TiD中的脱靶序列比CRISPR/Cas9中的少。与CRISPR/Cas9相比，这是一个优势，其中脱靶是关注点之一，这表明TiD可能在植物基因编辑中有效。
这些结果表明，TiD诱导的突变模式不同于其他CRISPR系统，如CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas3，TiD可用于开发新的基因编辑工具，且脱靶效应较小。

TiD的挑战和前景

在这项研究中，刑部教授和他的同事向世界展示了利用TiD在植物中进行基因编辑技术的可能性。这项研究成果是利用日本开发的TiD技术进行的，其意义不仅仅是植物基因编辑的成功。
目前，CRISPR/Cas9正在成为世界基因编辑的标准。自其出现以来，已陆续获得国外主要国家学术界的基础专利授权。此外，由于其作为商业工具的价值很高，对专利的有效性和对专利的反对意见存在着激烈的争议[12]。讽刺的是，CRISPR/Cas9本应是一项能够实现高效基因编辑的划时代技术，却因专利纠纷而面临成本上升的风险。如果这种趋势持续下去，势必会对日本的基因编辑研发成本产生重大影响。

在此背景下，日本德岛大学研发的TiD有可能成为日本基因编辑技术界的救星。目前，据说TiD的裂解效率不如CRISPR/Cas9，还有很多问题需要解决，比如需要设计一种工具来选择性地提取基因编辑细胞。这次TiD的实验，基因编辑的西红柿传给下一代的研究成果没有任何脱靶效应。基因编辑的世界有可能会发生巨大的变化。
节郎科技与刑部教授等展开合作研究，测试TiD在动物细胞中的反应性，并已达成TiD在动物细胞中的使用许可协议。我司为满足制药公司验证其产品运作的需求提供合同测试服务，若未来TiD技术进一步完善，TiD可能会成为取代CRISPR/Cas9成为新的基因编辑技术。我们可以持续密切关注TiD的发展趋势，它即将在刑部教授和他的团队的手中从日本德岛向世界展翅高飞。

参考文献

[1] Osakabe, K., Wada, N., Miyaji, T. et al. Genome editing in plants using CRISPR type I-D nuclease. Commun Biol 3, 648 (2020).

[2] Makarova, K. S. et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722–736 (2015).

[3] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015;163(3):759-771. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038

[4] Harms DW, Quadros RM, Seruggia D, et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Curr Protoc Hum Genet. 2014;83:15.7.1-15.7.27. Published 2014 Oct 1. doi:10.1002/0471142905.hg1507s83

[5] Ghorbal, M., Gorman, M., Macpherson, C. et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol 32, 819–821 (2014).

[6] Carl H. June, et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science 367, eaba7365 (2020)

[7] Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015;4(11):e264. Published 2015 Nov 17. doi:10.1038/mtna.2015.37

[8] Kosicki M, Tomberg K, Bradley A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol. 2018;36(8):765-771. doi:10.1038/nbt.4192

[9] 柴田潤一郎.「Machine learningとCRISPR/Cas9 -バイオインフォマティクスの発展と課題-」

[10] Dolan, A. E. et al. Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using type I CRISPR-Cas. Mol. Cell 74, 936–950 (2019).

[11] Osakabe K., Wada N., Murakami E., Osakabe Y. Genome editing in mammals using CRISPR type I-D nuclease. bioRxiv. 2020:991976. doi: 10.1101/2020.03.14.991976.

[12] 橋本 一憲、廣瀬咲子　「ゲノム編集技術の基本特許を巡る国際的動向及び研究開発への影響と対策」