概述：2018年4月广岛大学放射生物学与医学研究所的仲一仁副教授向节郎科技委托生产Gdpd3基因敲除小鼠，我们于当年9月通过外部育种家交付了3只F0小鼠。在那之后于2020年9月17日，我们的Gdpd3基因敲除小鼠分析结果被刊载于英国在线科学杂志Nature Communications上[1]。因此我们对于此研究背景和未来的发展前景进行了采访。

慢性骨髓性白血病和癌症干细胞的复发

年批准针对导致CML基因BCR-ABL1的酪氨酸激酶抑制剂(TKI: tyrosine kinase inhibitor)极大地改善了患者的治疗效果[2]。目前，对于如何克服TKI治疗后的复发是一个重要的问题。例如，有人尝试对仍处于缓解期的患者停用TKI伊马替尼，但据报道约有一半患者治愈，其余患者则复发。[3]

近年来，人们已经知道CML干细胞是造成CML复发原因的细胞。CML干细胞为CML细胞的根源。CML干细胞具有产生大量CML细胞的能力，但其本身却一直处于 “休眠 “状态，增殖活性低，导致产生TKI的耐药性。 虽然TKI对具有高增殖活性的CML细胞有效，但由于CML干细胞的增殖活性较低，被认为效果较差。因此，就算使用TKI治疗，CML干细胞仍能继续存活，导致复发。

因此，我们正在研究CML干细胞的生存和休眠机制，以开发针对CML干细胞的新治疗策略。

于CML癌干细胞中溶磷脂酶的表达亢进

我们之前曾经构建了一个CML干细胞的小鼠模型[4] 我们从这些易患CML的小鼠中分离出CML干细胞，并通过RNA-Seq分析其在CML干细胞中进行基因表达谱的解析。我们发现参与溶脂代谢的Gdpd3在CML干细胞中表达强烈。一般来说，构成细胞膜的磷脂有两个脂肪酸，而溶血磷脂只有一个脂肪酸，因此溶血磷脂比磷脂更具有亲水性，被认为具有自身的生物活性。众所周知，Gdpd3是一种酶，它能水解溶血磷脂生成溶血磷脂酸（LPA：lysophosphatidic acid）。 然而，为什么CML干细胞会高表达Gdpd3，以及對於溶血磷脂的作用到目前为止还没有任何的报道。

此外，我们发现Gdpd3基因缺失的CML干细胞的LPA生成减少，促进细胞增殖的AKT/mTORC1通路激活，以及参与干细胞维持的Foxo3a活性降低。最后，我们评估了缺乏Gdpd3基因的CML干细胞对于TKI抗性。我们发现，用TKI（达沙替尼）治疗可以显着改善来自Gdpd3基因敲除小鼠的CML干细胞移植小鼠的CML复发情况。这些结果表明，依据Gdpd3的介导，溶脂代谢在CML干细胞的维持中拥有着重要的脚色，Gdpd3的缺失导致CML干细胞无法保持休眠状态，并且降低对于TKI抗性。

敲除Gdpd3基因的小鼠于癌症干细胞无法保持休眠状态

但在研究极少数干细胞时，这一点很重要。越是少数干细胞所特有的功能重要分子，越是难以看到其表面特性。而如果我们能找到癌症干细胞特有的机制，就意味着副作用会越少。我们立即开始通过连续移植CML干细胞进行功能评估。我们从Gdpd3基因敲除小鼠及对照组的野生型小鼠中提取造血干细胞，并将它们导入BCR-ABL1基因后进行初次移植。
我曾预测(希望)也许从Gdpd3基因敲除小鼠中提取的CML干细胞由于其功能降低，不会发展成CML。 然而，结果却完全相反：来自Gdpd3基因敲除小鼠的CML干细胞比野生型小鼠的CML干细胞具有更高的致白血病潜能，而且所有小鼠都先死亡。这说明来自Gdpd3基因敲除小鼠的CML干细胞并未保持休眠状态，且增殖活性增加，导致无法长期保持干细胞活性。这一刻的震撼，就像被雷劈了一样。这时，我们才知道自然界是多么的伟大。为了证明这一点，我们从原发性移植小鼠中纯化了CML干细胞，并将其二次移植到另一只野生型小鼠中。这次则和预期一样，来自Gdpd3基因敲除小鼠的CML干细胞几乎失去了发展成CML的能力。事实上，当我们检查CML干细胞的增殖潜力时，我们发现大量的细胞处于由BrdU阳性表示的S期。 这些结果表明，当Gdpd3基因缺失时增加了CML干细胞的增殖潜力，并防止它们保持休眠状态。

此外，我们发现Gdpd3基因缺失的CML干细胞的LPA生成减少，促进细胞增殖的AKT/mTORC1通路激活，以及参与干细胞维持的Foxo3a活性降低。最后，我们评估了缺乏Gdpd3基因的CML干细胞对于TKI抗性。我们发现，用TKI（达沙替尼）治疗可以显着改善来自Gdpd3基因敲除小鼠的CML干细胞移植小鼠的CML复发情况。这些结果表明，依据Gdpd3的介导，溶脂代谢在CML干细胞的维持中拥有着重要的脚色，Gdpd3的缺失导致CML干细胞无法保持休眠状态，并且降低对于TKI抗性。

未来的展望

众所周知，大多数的CML细胞是通过BCR-ABL1等致癌基因依赖性的机制获得增殖活性。 使用抗癌药治疗可以抑制这种增殖活性从而达到治疗效果。 然而，导致复发的CML干细胞通过一种非癌细胞基因依赖性的机制获得休眠状态，这给抗癌药物治疗带来困难。本研究通过Gdpd3介导的溶脂代谢途径，阐明了一部分CML干细胞的休眠机制。

如果未来能开发出抑制Gdpd3的分子靶向药物，或许可以通过与TKI的联合并用进一步改善CML患者的将来。此外，我们还想对Gdpd3介导之其他类型的癌症干细胞的溶脂代谢进行功能分析。我们希望通过靶向作用于非依赖癌细胞基因之溶磷脂代谢形成癌症复发治疗的新概念。

对于节郎科技的期望

在我提出要求后，节郎科技公司只用了大约4个月的时间就生产出了Gdpd3基因敲除小鼠，让我们可以立即开始分析。 我对于节郎科技的产品品质和员工的真诚感到非常满意。基因敲除小鼠具有不可替代的价值，今后我还要继续进行研究。

此外，我认为建立转基因小鼠是基因编辑技术最可以有效利用的领域。希望很多医生们也能够考虑，让节郎科技的基因敲除小鼠能够得到广泛的应用。我本身也打算下次实验时也请节郎科技制作基因敲除小鼠。

追记

仲副教授谈到，如何利用基因敲除小鼠来进行数量极少的癌症干细胞之功能分析。 虽然大多数基因敲除小鼠的分析都是使用于表现型的观察，但分离基因缺失的癌症干细胞和生成疾病模型小鼠的独特方法让我们留下了深刻的印象。

＜参考文献＞
1.Naka K, Ochiai R, Matsubara E, et al. The lysophospholipase D enzyme Gdpd3 is required to maintain chronic myelogenous leukaemia stem cells. Nat Commun. 2020;11(1):4681.
2.Kantarjian H, O’Brien S, Jabbour E, et al. Improved survival in chronic myeloid leukemia since the introduction of imatinib therapy: a single-institution historical experience. Blood. 2012;119(9):1981-1987.
3.Mahon FX, Rea D, Guilhot J et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncol. 2010; 11: 1029-1035.
4.Naka K, Hoshii T, Muraguchi T, et al. TGF-b-FOXO signalling maintains leukaemia-initiating cells in chronic myeloid leukaemia. Nature. 2010;463(7281):676-680.