サービス内容

ゲノム編集受精卵作製受託サービス

業界初!ゲノム編集受精卵作製サービス。納品物はゲノム編集を施したマウス受精卵のみ。お客様側では受け取ったゲノム編集後の受精卵をご自身のSPFマウスに移植しますので、お客様の施設ですぐにF0解析が可能になります。

価格 :395,000 円(税別)~ 納期 : 14営業日~

ゲノム編集受精卵作製受託サービスのフローチャート
  1. 人工授精による受精卵調整
  2. エレクトロポレーション法によりCas9/crRNA/tracrRNAを受精卵に導入
  3. 培養(18hr程度)
  4. 2細胞期へと発生した受精卵を冷蔵。顧客へ宅配便

ゲノム編集マウス作製受託サービス

セツロテックの技術により、低コスト、短納期でゲノム編集マウスを作製いたします。また、セツロテックでは自社でマウスを管理しており、ゲノム編集マウス作製に対する様々なニーズにお応えいたします。

価格 : お問い合わせください。

納期 : 2か月~

ゲノム編集マウス作製のフローチャート
  1. 人工授精による受精卵調整
  2. エレクトロポレーション法によりCas9/crRNA/tracrRNAを受精卵に導入
  3. 培養(18hr程度)
  4. 仮親(偽妊娠マウス)の卵管へ移植
  5. 19日後出産。必要に応じ帝王切開
  6. 3週齢になった時点で、耳片からゲノムDNA調整。配列解析によりゲノム編集の成否を確認
  7. ゲノム編集マウスを顧客へ宅配便

ゲノム編集ブタ作製受託サービス

セツロテックの研究チームでは、世界に先駆けてゲノム編集ブタの作出に成功しています。古くからブタは生理学的、解剖学的にヒトと比較的近いとされ、例えばヒトの臓器と同等の大きさを持ち、実験動物として注目されてきました。セツロテックでは、実験用のゲノム編集ブタをオーダーメードで作出したします。

価格 : お問い合わせください。 納期 : お問い合わせください。

ゲノム編集培養細胞作製受託サービス

お客様がお持ちの任意の細胞に対し、特定塩基配列部位の欠損、点変異、長鎖DNAの挿入などをゲノム編集により加工するサービスです。

価格 :お問い合わせください。 納期 : 3ヵ月~

ゲノム編集培養細胞作製受託サービスのフローチャート
  1. 【ベクター構築ステップ】 お客様より培養細胞のストックと培養プロトコールをお送りいただきます。
  2. 導入するベクター等を構築します。
  3. 【ゲノム編集ステップ】 培養細胞を起こし状態のよいタイミングで弊社独自の方法によりゲノム編集を実施します。
  4. 抗生物質によりクローンをセレクションします。
  5. 【ジェノタイピングステップ】 クローンごとにジェノタイピングを行いクローンを絞り込み、当たりクローンのシーケンスを行います。
  6. ご希望のクローンを納品します。

こんなニーズはありませんか?

  • 自分が研究しているテーマに関連するすべての候補遺伝子のノックアウトマウスを作りたい
  • 一度に10遺伝子を欠損させたノックアウトマウスを作ってみたい
  • 2 kb、3 kbもの長い外部DNAを挿入したノックインマウスを作りたい
  • いろいろなfloxマウスを作りたい

難しいテーマもご相談ください。最適なソリューションをご提供させていただきます。

技術内容

受精卵エレクトロポレーション法(GEEP 法)とは、Cas9 タンパク質及びgRNA といったゲノム編集ツールをエレクトロポレーションによって受精卵に導入する方法です。このGEEP法ではCRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールをハイスループット・低コストかつ、ダメージの少ないかたちで受精卵に導入することができるため、例えば、遺伝子改変マウスの作製が非常に簡便になり、安価に提供することができます。従来、遺伝子改変マウスを作製する目的には、マイクロインジェクション法が主に用いられます。マイクロインジェクション法は、ガラスキャピラリーという非常に細いガラス管を用いて、顕微鏡下でCRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを受精卵一つ一つに注入する方法で、操作技術が求められるほか、専用の設備が必要です。これに比べてGEEP法では、必要な技術は受精卵を電極に並べることのみです。加えて、受精卵を一つ一つ操作する煩雑な作業を介すことなく、複数個(20 個~ 200 個)の受精卵へ同時にゲノム編集ツールを導入することができます。このような新たな技術を活用することで、人工受精後の卵が新鮮なうちに、短時間で均一な条件下で、低侵襲にゲノム編集を行えるというメリットを産み出し、高効率でゲノム編集生物を得ることが期待できます。また、マウスのみならずブタへのGEEP法の応用も可能となりました。

比較表
セツロテック 他社
ゲノム編集マウス作製法 受精卵エレクトロポレーション法 (GEEP法)受精卵エレクトロポレーション法(GEEP法) マイクロインジェクション法 マイクロインジェクション法
100コの受精卵の取扱時間 15分以内 120分以上
ゲノム編集生物の発生率 高い 中程度
ノックアウトマウス
ノックインマウス テスト テスト
多因子疾患モデル生物
ゲノム編集受精卵での納品
F0解析
ブタなど他の哺乳類のゲノム編集
コスト 安い 高い

100個の受精卵を操作した時の比較

セツロテックの技術 /受精卵エレクトロポレーション法
ステップが少なく単純
他社(従来)の技術 /マイクロインジェクション法
ステップが多く複雑

よくある質問

ゲノム編集受精卵で引渡しされる受精卵数はどのくらいですか。
最低単位で100個以上となります。それ以上ご希望の場合は応相談となります。
ゲノム編集マウスは、何匹以上の引渡しとなりますか。
最低数については、恐縮ですが匹数を保証しかねます。受精卵作成100個の注文で最高20匹前後となり、それ以上をご希望の場合は、受精卵の発注数を増やすなど応相談となります。
マウス作成依頼した場合の代金の支払い方法を教えて下さい。
マイルストーン型支払(作業工程ごとに料金を分けてお支払頂く方式)となります。例えば、一般的なゲノム編集マウス作成では、代金支払いは以下の2回分けられます。ゲノム編集受精卵の生存を確認し、マウスに胚移植した段階で作業報告書・請求書を発行し、ゲノム編集受精卵作成の代金をお支払頂きます。また、ゲノム編集マウスを出荷した段階で、作業報告書と請求書を発行し、残額をお支払頂きます。
受精卵、マウスの送料はどの程度になるのでしょうか?
受精卵については送料が含まれています。マウスについてはお見積りさせて頂きます(¥50,000~)。
ゲノム編集実験を委託する際に必要となる添付書類を教えて下さい。
所属機関の承諾印と承諾番号の記載されている、遺伝子組換え実験計画書と動物実験計画書の添付が必要となります。書式はご依頼者の所属機関のものをご利用下さい。所属機関がゲノム編集は遺伝子組換えに当たらないとの見解であれば、遺伝子組換え実験計画書の添付は必要ありません。
エクソンなど大きな領域を飛ばすようなノックアウトマウスはできますか?
エクソンなど大きな領域を飛ばす場合は、二つのgRNAを共導入することで二カ所切断を引き起こし、間のエクソンなどを飛ばします。5kb程度までは問題なく起こります。場合によっては20kbでも飛ぶことが確認できています。
マウスの系統はB6のほか、何に対応できますか?輸送などで破損してしまう系統を懸念しています。
B6などの純系、B6D2F1などのハイブリッド系、ICRなどのアウトブリッドでも実績があります。ただ、輸送をテストしたのはB6、B6D2F1、ICRです。
ゲノム編集受精卵を作成するマウスと仮親として使うマウスを教えて下さい。
ゲノム編集受精卵を作成するマウスは、C57BL6/Nが最も実績が多くお勧めしています。当然、別のマウスの使用をご希望の場合はご用意させ頂きますが、入手までお時間を頂くことがございます。仮親マウスは原則としてICRマウスを使用しています。
仮親マウスに胚移植するとき、受精卵をいくつ移植すればいいですか。
参考までに、弊社では片腹に15個づつ、合計で30個を標準として移植しております(生まれてくるのは、そのうちの10匹/腹ほどとなります)。
研究チームでの経験では、少し多めに入れた方が着床の具合が良いようです。
ただ、厳密なプロトコールはなく、現場研究者の実験経験や移植する総受精卵数に応じ柔軟に対応しています。
移植経験が豊富な研究者の方であれば、現在お使いのプロトコールで問題ございません。
使っているCas9には核移行シグナルはありますか?
Cas9に核移行シグナルは付いています。
ssODNの長さは最長で何kbでワークしていますか?
ssODN(合成オリゴ)では34bpのloxPの挿入が最長です。合成オリゴを使う場合、大抵の配列は挿入できます。ssDNAでは、EGFP(700bp程度)の導入経験があります。ただし、効率は低いので、現在改善のための研究を進めています。
ゲノム編集受精卵の輸送は、冷蔵のほうがダメージが少ないようだが対応可能ですか?
冷凍、冷蔵、両方に対応可能です。ただし、冷蔵の場合は冷蔵開始後72時間以内の移植が必要です。冷蔵は0.5mlのチューブで行っています。
ゲノム編集受精卵を冷凍で輸送できるでしょうか。
冷凍胚につきましては、弊社でまだ検証中の段階でございまして、以下の条件にご同意頂く必要がございます。
・凍結胚の送付については、冷蔵胚と同等の品質かどうか検証の途中であること
・凍結胚が到着後、1か月以内に胚移植を実施して頂けること
・胚移植後、1か月以内に受精卵の生存率とマウスの出生率をご報告頂けること
・凍結胚の解凍プロトコールはセツロテックの指示に従って頂くこと
・頂いたデータは、セツロテックの技術資料として発表させて頂く場合があること
・凍結胚に万一のトラブルがあった場合、無償で改めて冷蔵胚を送付させて頂くこと
冷蔵保存はどのような方法に則って行っているのですか?
熊本大学CARD(Center for Animal Resources and Development)に則っています。以下からご確認下さい
2細胞期胚の冷蔵保存・輸送についてhttp://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/teion/lowtemptransp.html
2Cellのステージで輸送できますか?
2cell stageの方が安定なので、2 cell ステージで輸送です。
日曜日に発送できますか?(火曜日に移植したい)
追加のお見積りになりますが、日程により対応は可能です。
トランスジェニックマウスにも対応できますか?
トランスジェニックマウスは現時点では対応していません。
2018年1月現在までの実験実績を教えて下さい
弊社研究チームでは、ノックアウトマウスについては50件以上実験しており、成功しています。ノックインマウスでは10件以上の実験実績があります。コンディショナルノックアウトマウスについては、10件弱の実験実績があります。
1塩基置換ノックインマウス作製実績を教えてください。
2017年5月現在、当社研究チームでは約10件の1塩基置換を実施し、すべての1塩基置換マウスが作製できております。しかしながら、うち一件は3度の実験を必要としました。成否を決定しているのはcrRNA配列です。切断しやすい配列が希望される塩基のそばにあれば、塩基置換がうまくいく可能性が上がります。
QAに、ノックインがうまく行かない場合に、3回実験を行ったケースがあるというコメントがありますが、その場合追加料金が必要となるのですか。
ノックインマウスは、納期が製造から3カ月が原則ですが、再実験により6か月、9ヶ月と延びていきます。再実験の追加費用は戴きません。ただ、できるまで実験を続けることは保証しておらず、弊社からお断りさせて頂くことがございます。
crRNAの設計ができない場合はありますか?
設計できない可能性はありますが予測可能です。その場合は、下記フローの(iii)でお伝えいたします。なお、その場合、一切の費用は発生いたしません。 【研究受託までの流れ】 (i)  NDA締結 (ii)  御社からの改変配列情報の提供 (例:遺伝子Aの344番目のセリンをアラニンに変更) (iii)  弊社で実験計画(crRNA配列の決定、組換えオリゴ配列の決定) (iv)  実験計画を御社に提案 (v) 契約 (vi) 実験開始
ノックインマウスの納期を教えてください。
納期は最短3ヶ月です。再実験が必要な場合は、6ヶ月、9ヶ月となっていきます。納品するのは、ファウンダー世代(F0)マウスです。目的とする変異が導入されているF0マウスをお送りします。F1、F2マウスをご希望の場合、別途ご相談ください。
納品物の検証方法を教えてください。
F0マウスから抽出したゲノムに対してPCRを行い、増幅フラグメントのシーケンスをします。目的の塩基置換が導入されたことを確認します。F0マウスはヘテロになる確率が高いですが、場合によってはモザイク個体となる場合があります(ゲノム編集マウス作製では起こることがあります)。
ホモKOは離乳前に死んでしまうので、ヘテロ体が取れないと難しいのでは?
ゲノム編集では優先的に遺伝子破壊(KO)が起こります。そのうち、ある程度の頻度でノックイン(KI)となります。従いまして、今回のような致死遺伝子の場合、目的マウスが取れにくいのは事実です。仮に、一方のalleleがKO、もう一方のalleleがKIの場合、マウスは生存するなら、取れる可能性が高いです。生存しない場合、人工授精法(IVF)を用いることでKI個体を取ることになります(要見積)。
一度にいくつかで遺伝子破壊できるか。
同時に3つの遺伝子を破壊した経験があります。変異導入も可能と思いますが、2017年5月現在、現時点で確実にできるとはお答えできません。
レポーター遺伝子をつけることは可能でしょうか。
レポーター遺伝子をお付けするには、特許のライセンスの問題がございます。
ライセンスフリーのものでしたらお付けできるのですが、有料となりますと、ライセンス交渉を経た上での、成果報酬型の案件となってまいります。
floxマウスの作製実績。その場合のゲノム編集を使った方法はどのようなものですか。flox動物作製にどれくらいの期間が必要ですか。
2017年5月現在、floxマウスを4系統作成しました。 方法:まずは、loxPを1箇所導入したマウスを作成しておき、そのマウスを使用して得られた受精卵(loxPを1つ保持)に2つめのloxPを導入しています。同時に2箇所loxPを導入する実験を何度か試しましたが、2つの切断箇所のあいだのゲノムDNAが欠失してしまいました。 作製期間:約10ヶ月〜1年
gRNA、ドナーDNA等の設計委託は可能か?
設計は基本料に含まれております。当方で設計し、ご確認後に正式なご発注の流れになります。
実験で使用するドナーベクターの構造は事前に連絡してくれますか。
弊社の技術では、受精卵にCas9タンパク質とgRNAとtracrRNAを直接導入するため、ベクターは使用しません。ターゲット遺伝子名を教えて頂き、gRNAの設計をご提案し、ご承認を頂いてから実験に着手します。
弊社に依頼した場合には、研究室・研究機関で独自に使っているsgRNAは使用できませんか。
使用できます。配列情報を頂ければ、こちらで合成して実験に用います。
研究室・研究機関で独自に使っているcrRNA、sgRNAを使用したいときは、どのように輸送すればよいでしょうか。
凍結乾燥品での輸送をお願いします。凍結乾燥品での輸送が難しいようでしたら、次の条件でお願いします。
①Opti-MEMIで、
②濃度 2 ug/uLになるように溶かしてください。
③sgRNAかcrRNAかどちらかわかるように記入をお願いします。
④冷凍で輸送をお願いします。
⑤crRNAは、5-6uL程度あれば十分ですが、量も少ないので、念の為10uL冷凍送付いただければ安心です。
動物実験施設の基準を教えてください。
国の実験動物指針に従っております。 http://cms.db.tokushima-u.ac.jp/DAV/organization/10998/anex-HP/anex/aigo-c/aigo-c.html SPFグレードで飼育しており、検査項目は以下のリンクの通りです。 http://cms.db.tokushima-u.ac.jp/DAV/organization/10998/anex-HP/anex/microbe/microbe%20-%202.html 検査は実験動物中央研究所に依頼しております。
受精卵エレクトロポレーション法はモザイク率が低いという事ですが、モザイクかどうかはどのように判断していますか?
個体からゲノムを調整して、PCRにて標的配列を増幅。増幅したフラグメントのゲノム編集パターンが何種類かで判断しております。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27474397

参考文献

  1. Hashimoto, M. and Takemoto, T*. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Sci. Rep. 5, 11315; doi: 10.1038/srep11315 (2015).
  2. Hashimoto M, Yamashita Y, Takemoto T*.Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev. Biol. 418: 1-9 (2016).
  3. Tanihara F, Takemoto T*, Kitagawa E, Rao S, Do L, Onishi A, Yamashita Y, Kosugi C, Suzuki H, Sembon S, Suzuki S, Nakai M, Hashimoto M, Yasue A, Matsuhisa M, Noji N, Fujimura T, Fuchimoto Di, Otoi T*. Somatic cell reprogramming-free generation of genetically modified pigs. Science Advances. 2 (9) e1600803 (2016).
 
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