サービス内容

ゲノム編集受精卵作製受託サービス

業界初!ゲノム編集受精卵作製サービス。納品物はゲノム編集を施したマウス受精卵のみ。お客様側では受け取ったゲノム編集後の受精卵をご自身のSPFマウスに移植しますので、お客様の施設ですぐにF0解析が可能になります。

価格 :395,000 円(税別)~ 納期 : 14営業日~

ゲノム編集受精卵作製受託サービスのフローチャート
  1. 人工授精による受精卵調整
  2. エレクトロポレーション法によりCas9/crRNA/tracrRNAを受精卵に導入
  3. 培養(18hr程度)
  4. 2細胞期へと発生した受精卵を凍結。顧客へ宅配便

ゲノム編集マウス作製受託サービス

セツロテックの技術により、低コスト、短納期でゲノム編集マウスを作製いたします。また、セツロテックでは自社でマウスを管理しており、ゲノム編集マウス作製に対する様々なニーズにお応えいたします。

価格 : お問い合わせください。

納期 : 2か月~

ゲノム編集マウス作製のフローチャート
  1. 人工授精による受精卵調整
  2. エレクトロポレーション法によりCas9/crRNA/tracrRNAを受精卵に導入
  3. 培養(18hr程度)
  4. 仮親(偽妊娠マウス)の卵管へ移植
  5. 19日後出産。必要に応じ帝王切開
  6. 3週齢になった時点で、耳片からゲノムDNA調整。配列解析によりゲノム編集の成否を確認
  7. ゲノム編集マウスを顧客へ宅配便

ゲノム編集ブタ作製受託サービス

セツロテックの研究チームでは、世界に先駆けてゲノム編集ブタの作出に成功しています。古くからブタは生理学的、解剖学的にヒトと比較的近いとされ、例えばヒトの臓器と同等の大きさを持ち、実験動物として注目されてきました。セツロテックでは、実験用のゲノム編集ブタをオーダーメードで作出したします。

価格 : お問い合わせください。 納期 : お問い合わせください。

こんなニーズはありませんか?

  • 自分が研究しているテーマに関連するすべての候補遺伝子のノックアウトマウスを作りたい
  • 一度に10遺伝子を欠損させたノックアウトマウスを作ってみたい
  • 2 kb、3 kbもの長い外部DNAを挿入したノックインマウスを作りたい
  • いろいろなfloxマウスを作りたい

難しいテーマもご相談ください。最適なソリューションをご提供させていただきます。

技術内容

受精卵エレクトロポレーション法(GEEP 法)とは、Cas9 タンパク質及びgRNA といったゲノム編集ツールをエレクトロポレーションによって受精卵に導入する方法です。このGEEP法ではCRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールをハイスループット・低コストかつ、ダメージの少ないかたちで受精卵に導入することができるため、例えば、遺伝子改変マウスの作製が非常に簡便になり、安価に提供することができます。従来、遺伝子改変マウスを作製する目的には、マイクロインジェクション法が主に用いられます。マイクロインジェクション法は、ガラスキャピラリーという非常に細いガラス管を用いて、顕微鏡下でCRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを受精卵一つ一つに注入する方法で、操作技術が求められるほか、専用の設備が必要です。これに比べてGEEP法では、必要な技術は受精卵を電極に並べることのみです。加えて、受精卵を一つ一つ操作する煩雑な作業を介すことなく、複数個(20 個~ 200 個)の受精卵へ同時にゲノム編集ツールを導入することができます。このような新たな技術を活用することで、人工受精後の卵が新鮮なうちに、短時間で均一な条件下で、低侵襲にゲノム編集を行えるというメリットを産み出し、高効率でゲノム編集生物を得ることが期待できます。また、マウスのみならずブタへのGEEP法の応用も可能となりました。

比較表
セツロテック 他社
ゲノム編集マウス作製法 受精卵エレクトロポレーション法 (GEEP法)受精卵エレクトロポレーション法(GEEP法) マイクロインジェクション法 マイクロインジェクション法
100コの受精卵の取扱時間 15分以内 120分以上
ゲノム編集生物の発生率 高い 中程度
ノックアウトマウス
ノックインマウス テスト テスト
多因子疾患モデル生物
ゲノム編集受精卵での納品
F0解析
ブタなど他の哺乳類のゲノム編集
コスト 安い 高い

100個の受精卵を操作した時の比較

セツロテックの技術 /受精卵エレクトロポレーション法
ステップが少なく単純
他社(従来)の技術 /マイクロインジェクション法
ステップが多く複雑

よくある質問

エクソンなど大きな領域を飛ばすようなノックアウトマウスはできますか?
エクソンなど大きな領域を飛ばす場合は、二つのgRNAを共導入することで二カ所切断を引き起こし、間のエクソンなどを飛ばします。5kb程度までは問題なく起こります。場合によっては20kbでも飛ぶことが確認できています。
マウスの系統はB6のほか、何に対応できますか?輸送などで破損してしまう系統を懸念しています。
B6などの純系、B6D2F1などのハイブリッド系、ICRなどのアウトブリッドでも実績があります。ただ、輸送をテストしたのはB6、B6D2F1、ICRです。
使っているCas9には核移行シグナルはありますか?
Cas9に核移行シグナルは付いています。
ssODNの長さは最長で何kbでワークしていますか?
ssODN(合成オリゴ)では34bpのloxPの挿入が最長です。合成オリゴを使う場合、大抵の配列は挿入できます。ssDNAでは、EGFP(700bp程度)の導入経験があります。ただし、効率は低いので、現在改善のための研究を進めています。
ゲノム編集受精卵の輸送は、冷蔵のほうがダメージが少ないようだが対応可能ですか?
冷凍、冷蔵、両方に対応可能です。ただし、冷蔵の場合は冷蔵開始後72時間以内の移植が必要です。冷蔵は0.5mlのチューブで行っています。
2Cellのステージで輸送できますか?
2cell stageの方が安定なので、2 cell ステージで輸送です。
日曜日に発送できるか?(火曜日に移植したい)
追加のお見積りになりますが、日程により対応は可能です。
トランスジェニックマウスにも対応できますか?
トランスジェニックマウスは現時点では対応していません。
1塩基置換ノックインマウス作製実績を教えてください。
2017年5月現在、当社研究チームでは約10件の1塩基置換を実施し、すべての1塩基置換マウスが作製できております。しかしながら、うち一件は3度の実験を必要としました。成否を決定しているのはcrRNA配列です。切断しやすい配列が希望される塩基のそばにあれば、塩基置換がうまくいく可能性が上がります。
crRNAの設計ができない場合はありますか?
設計できない可能性はありますが予測可能です。その場合は、下記フローの(iii)でお伝えいたします。なお、その場合、一切の費用は発生いたしません。 【研究受託までの流れ】 (i)  NDA締結 (ii)  御社からの改変配列情報の提供 (例:遺伝子Aの344番目のセリンをアラニンに変更) (iii)  弊社で実験計画(crRNA配列の決定、組換えオリゴ配列の決定) (iv)  実験計画を御社に提案 (v) 契約 (vi) 実験開始
ノックインマウスの納期を教えてください。
納期は最短3ヶ月です。再実験が必要な場合は、6ヶ月、9ヶ月となっていきます。納品するのは、ファウンダー世代(F0)マウスです。目的とする変異が導入されているF0マウスをお送りします。F1、F2マウスをご希望の場合、別途ご相談ください。
納品物の検証方法を教えてください。
F0マウスから抽出したゲノムに対してPCRを行い、増幅フラグメントのシーケンスをします。目的の塩基置換が導入されたことを確認します。F0マウスはヘテロになる確率が高いですが、場合によってはモザイク個体となる場合があります(ゲノム編集マウス作製では起こることがあります)。
ホモKOは離乳前に死んでしまうので、ヘテロ体が取れないと難しいのでは?
ゲノム編集では優先的に遺伝子破壊(KO)が起こります。そのうち、ある程度の頻度でノックイン(KI)となります。従いまして、今回のような致死遺伝子の場合、目的マウスが取れにくいのは事実です。仮に、一方のalleleがKO、もう一方のalleleがKIの場合、マウスは生存するなら、取れる可能性が高いです。生存しない場合、人工授精法(IVF)を用いることでKI個体を取ることになります(要見積)。
一度にいくつかで遺伝子破壊できるか。
同時に3つの遺伝子を破壊した経験があります。変異導入も可能と思いますが、2017年5月現在、現時点で確実にできるとはお答えできません。
floxマウスの作製実績。その場合のゲノム編集を使った方法はどのようなものですか。flox動物作製にどれくらいの期間が必要ですか。
2017年5月現在、floxマウスを4系統作成しました。 方法:まずは、loxPを1箇所導入したマウスを作成しておき、そのマウスを使用して得られた受精卵(loxPを1つ保持)に2つめのloxPを導入しています。同時に2箇所loxPを導入する実験を何度か試しましたが、2つの切断箇所のあいだのゲノムDNAが欠失してしまいました。 作製期間:約10ヶ月〜1年
gRNA、ドナーDNA等の設計委託は可能か?可能な場合、設計経験と実績。
設計は基本料に含まれております。当方で設計し、ご確認後に正式なご発注の流れになります。
動物実験施設の基準を教えてください。
国の実験動物指針に従っております。 http://cms.db.tokushima-u.ac.jp/DAV/organization/10998/anex-HP/anex/aigo-c/aigo-c.html SPFグレードで飼育しており、検査項目は以下のリンクの通りです。 http://cms.db.tokushima-u.ac.jp/DAV/organization/10998/anex-HP/anex/microbe/microbe%20-%202.html 検査は実験動物中央研究所に依頼しております。
受精卵エレクトロポレーション法はモザイク率が低いという事ですが、モザイクかどうかはどのように判断していますか?
個体からゲノムを調整して、PCRにて標的配列を増幅。増幅したフラグメントのゲノム編集パターンが何種類かで判断しております。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27474397

参考文献

  1. Hashimoto, M. and Takemoto, T*. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Sci. Rep. 5, 11315; doi: 10.1038/srep11315 (2015).
  2. Hashimoto M, Yamashita Y, Takemoto T*.Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev. Biol. 418: 1-9 (2016).
  3. Tanihara F, Takemoto T*, Kitagawa E, Rao S, Do L, Onishi A, Yamashita Y, Kosugi C, Suzuki H, Sembon S, Suzuki S, Nakai M, Hashimoto M, Yasue A, Matsuhisa M, Noji N, Fujimura T, Fuchimoto Di, Otoi T*. Somatic cell reprogramming-free generation of genetically modified pigs. Science Advances. 2 (9) e1600803 (2016).
 
ページの先頭へ